Перевод названия: Heteroduplex analysis and pyrosequencing in the diagnostic algorithm of polycythemia vera associated with JAK2 exon 12 mutations
Тип публикации: статья из журнала
Год издания: 2017
Идентификатор DOI: 10.17116/labs20176129-33
Ключевые слова: exon 12 JAK2 mutations, myeloproliferative neoplasms, polycythemia vera, Heteroduplex analysis, мутации в 12-м экзоне гена JAK2; миелопролиферативные опухоли; истинная полицитемия; гетеродуплексный анализ
Аннотация: Соматические мутации в 533—547 кодонах 12-го экзона гена JAK2 высокоспецифичны для подтверждения диагноза истинной полицитемии (ИП). Частота встречаемости таких мутаций среди больных составляет от 3 до 23% в разных этнических группах. Ранее нами был предложен метод анализа мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 в количественном формате меПоказать полностьютодом пиросеквенирования. Вместе с тем высокая стоимость секвенирования определяет необходимость разработки двухэтапного алгоритма тестирования с предварительным использованием более доступного скринингового теста. Цель — продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) для выявления ИП-специфических мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 в качестве предварительного скринингового теста. Материал и методы. В работе были использованы пробы венозной крови: 28 женщин (средний возраст 53,1±14,9 года) и 112 мужчин (средний возраст 44,2±15,2 года), направленных врачами-гематологами с подозрением на ИП. После выделения ДНК проводили ПЦР с дополнительным этапом образования гетеродуплексов с использованием набора реагентов ПЦР-комплект («Синтол», Москва) на приборе CFX-96 («Bio-Rad», США). ПЦР-продукты детектировали методом электрофореза в 8% ПААГ. Подтверждение, идентификацию и количественный анализ уровня аллельной нагрузки выявленных мутаций проводили методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия). Результаты. Среди всех V617F-негативных пациентов, обследованных нами, использование метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволило идентифицировать 4 образца, содержащие мутации в области 12-го экзона гена JAK2. Тип мутации для этих пациентов определен методом пиросеквенирования: N542-E543del (c.1624_1629delAATGAA); I540-E543delinsKK (с.1619_1627 TCAgAAATgAAA); N542_E543del (c.1623_1628delAAATGA) и R541_E543K (c.1622_1627delGAAATG). Выводы. Предлагаемый вариант гетеродуплексного анализа с детекцией в ПААГ может быть рекомендован к использованию как скрининговый тест, предшествующий подтверждающему количественному тесту в реакции пиросеквенирования. Двухэтапный подход позволяет оптимизировать алгоритм и повысить эффективность тестирования пациентов с подозрением на мутации в 12 экзоне гена JAK2. Somatic mutations in codons 533-547 of JAK2 exon 12 are highly specific to confirm the diagnosis of polycythemia vera (PV). The frequency of JAK2 exon 12 mutations in PV patients is from 3 to 23% in different ethnic groups. We have previously proposed techniques for the detection and quantification of JAK2 exon 12 allelic load using a pyrosequencing method. However, the high cost of sequencing determines the need to develop a two-stage algorithm for the JAK2 exon 12 mutations detection using the preliminary available screening test. Purpose. Demonstrate the feasibility of using heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE for the JAK2 exon 12 mutations detection as the preliminary screening test. Material and methods. 140 peripheral blood samples from V617F-negative PV patients (28 women, mean age 53.1±14.9 years and 112 men, mean age 44.2±15.2 years), who had a high clinical and hematological probability of PV diagnosis were included in this study. The PCR with the additional stage of formation heteroduplexes was performed using the Real-time PCR kit («Syntol», Russia) and CFX 96 Real Time System («Bio-Rad», USA). PCR products were analyzed by electrophoresis in 8% PAGE. The presence of the mutations was identified and confirmed by pyrosequencing method with PyroMark Q24 («Qiagen», Germany). Results. Detection of JAK2 exon 12 mutations using a heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE has allowed to identify four patients with mutations among 140 of V617F-negative patients, who had a high clinical and hematological probability of PV diagnosis. Different types of mutations for these patients have been clarified by pyrosequencing: N542-E543del (c.1624_1629delAATGAA); I540-E543delinsKK (с.1619_1627 TCAgAAATgAAA); N542_E543del (c.1623_1628delAAATGA) and R541_E543K (c.1622_1627delGAAATG). Conclusions. The proposed variant of the heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE can be recommended for use as the preliminary screening test which is carried out before the confirming pyrosequencing. The two-stage approach allows to optimize the algorithm of the JAK2 exon 12 mutations detection and improve the efficiency of testing for patients suspected of having polycythemia vera in whom a JAK2 V617F mutation is not detected.
Журнал: Лабораторная служба
Выпуск журнала: Т. 6, № 1
Номера страниц: 29-33
ISSN журнала: 23052198
Место издания: Москва
Издатель: Общество с ограниченной ответственностью Издательство Медиа Сфера