Год издания: 2025
Ключевые слова: скорость оборота фермента, бактериальная люцифераза, биолюминесценция, ингибирование продуктом, сопряженные ферменты, ингибиторный ферментативный биотест, биосенсор
Аннотация: Проект направлен на раскрытие механизмов функционирования ферментов как эффективных биокатализаторов белковой природы, чьи молекулярные структурно-динамические свойства сформировались под давлением разнонаправленных факторов отбора: необходимости стабилизировать различные интермедиаты в каталитическом цикле и при этом способствоватПоказать полностьюь увеличению, с одной стороны, скорости химической реакции, а с другой – скорости оборота фермента. В частности, рассмотрена такая распространённая проблема в работе ферментов как снижение скорости оборота вследствие медленного высвобождения продукта реакции. Определение механизмов регуляции скорости оборота ферментов является важной задачей, как для понимания принципов организации метаболических путей в клетках, так и для развития эффективных биокаталитических технологий на основе ферментов. Задачей проекта является выяснение механизмов низкой скорости оборота бактериальной люциферазы – флавиновой монооксигеназы с уникальной функцией производства в результате реакции кванта света, и нахождение способов увеличения эффективности мультиферментых систем на основе этого фермента. Биолюминесцентная реакция, катализируемая бактериальнаой люциферазой, используется в качестве репортерной системы в аналитических системах, как ферментативного, так и клеточного типа, в экотоксикологии. Низкий квантовый выход реакции и замедленная скорость оборота фермента осложняет применение этой системы для оптического биоимджинга. Для решения задач проекта, во-первых, будут изучены закономерности реактивации люцифераз двух типов – с «медленной» и «быстрой» кинетикой (LuxAB из lux-оперона бактерий V. harveyi и P. leiognathi соответственно) после реакции с альдегидами с разной длиной цепи, а также будет проанализирована зависимость скорости реактивации люцифераз от полярности среды и присутствия белков-адсорбентов. Во-вторых, методами бионформатики и молекулярной динамики будут проведен поиск участков полипептидной цепи бактериальной люциферазы, ответственных за различия в скорости реактивации (оборота). В-третьих, будут получены NADH:FMN-оксидоредуктазы lux-оперона бактерий V. harveyi и P. leiognathi (LuxG) и изучены свойства сопряженных систем LuxG+LuxAB двух видов бактерий, в частности, определена скорость оборота люциферазы при работе в биферментной системе. Для редуктаз LuxG также будет выполнен структурный анализ с целью выявления участков последовательности, ответственных за различия в функциональных характеристиках. На основе полученных данных о зависимости скорости оборота бактериальной люциферазы от вида бактерий, длины цепи альдегида, физико-химических свойств среды, присутствия дополнительных белков, типа оксидоредуктазы планируется получить биферментную биолюминесцентную систему с повышенной скоростью оборота ферментов. Кроме того, установленные структурно-функциональные связи для исследованных ферментов могут быть в дальнейшем использованы для рационального молекулярного дизайна высокоэффективных биолюминесцентных систем мультиферментного (каскадного) типа или с целью повышения скорости оборота других флавиновых монооксигеназ для биотехнологических целей. Таким образом, в результате выполнения проекта будут впервые выявлены различия в механизмах реактивации бактериальных люцифераз с разным типом кинетики при работе в сопряжении с природной редуктазой lux-оперона и описана связь скорости оборота со структурой исследованных ферментов.