Тип публикации: отчёт о НИР
Год издания: 2016
Ключевые слова: биолюминесцентный анализ, почва, почвенный покров, оценка токсичности, ферментативные биотесты токсичности, экологический мониторинг, люцифераза, НАДН:ФМН-оксидоредуктаза, многокомпонентный иммобилизованный реагент
Аннотация: Настоящий проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы мониторинга окружающей среды, обеспечение экологической безопасности и приемлемого качества почв и почвенного покрова. Решение проблемы важно для всех сфер хозяйственного комплекса страны, особенно для аграрной сферы, на которую возложены задачи импортозамещенияПоказать полностьюзарубежных продуктов растениеводства, при производстве возрастающих объемов и надлежащего качества продукции растениеводства.?Актуальность проекта связана, в первую очередь, с необходимостью разрешения таких острых проблем как определение механизмов устойчивости и саморегуляции почвы на всех уровнях ее организации и использования, количественной диагностики состояния и поддержания плодородия и предотвращения деградации почвы, выбора высокоинформативных функциональных и фактологических оценочных критериев, имеющих экологическую и экономическую значимость, разработки системы научно обоснованных методов оздоровления деградированных и нарушенных почв. В подобной ситуации поиск интегральных характеристик оценки токсичности почв, позволяющих оценить последствия воздействия человека на эдафотоп, представляется актуальным. В равной степени это относится и к другим природным средам – вода и воздух. При этом следует констатировать отсутствие в мировой практике развитой методологии комплексного биотестирования почв, воды и воздуха как природных, так и искусственных экосистем. Вместо этого наблюдается тенденция к применению отдельных биотестов, что приводит к неадекватному отражению степени загрязнения окружающей среды и влиянию ее на человека. Действительно, оценку токсичности проводят по влиянию почвы, воды или воздуха на отдельные функции организма, такие как дыхание, подвижность, рост, пищеварение и т.п. Кроме того, использование в биотестах живых организмов и культур приводит к большой ошибке измерения. Предлагаемая в проекте «ферментативная функциональная модель живого организма» (ФМО) как комплексный биотест может помочь в решении обозначенной проблемы. Этот комплексный биотест сконструирован из набора ферментативных биотестов, в которых осуществляется связь «ключевые ферменты – функция организма». В сумме набор таких ключевых ферментов должен адекватно отражать влияние токсичной среды на жизнедеятельность организма в целом. В системе биотестов такой комплексный биотест необходим, так как он отражает влияние токсичной среды на молекулярном уровне.?Целью исследования является разработка новой методологии комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий.?Достигнутыми научными результатами работ по проекту за 2016 год являются:?1. Обоснована предлагаемая для разработки авторами проекта экспрессная биолюминесцентная тест-система «ФМО (Ферментативная модель человека)» для комплексного анализа экологического состояния почвенного покрова. В состав данной модели входят ферменты, которые выполняют разнообразные функций в живом организме, такие как: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (ключевой фермент вторичного пути катаболизма глюкозы - пентозофосфатного пути); лактатдегидрогеназа (ключевой фермент молочно-кислого брожения); НАДH-ФМН-оксидоредуктаза (один из ключевых ферментов дыхания); трипсин и химотрипсин (ключевые ферменты пищеварения белков); алкогольдегидрогеназа (ключевой ферментов детоксикации спиртов) и бутирилхолинэстераза (ключевой фермент нервной проводимости).?2. Предложены принципы, алгоритмы и приемы конструирования полиферментных биотестов для построения комплексного ферментативного теста ФМО на основе различных типов взаимодействий ферментов. Основными способами достижения необходимой чувствительности ферментативных тестов являются- изменение соотношения компонентов реакционной смеси; изменение процедуры пробоподготовки; варьирование характеристиками используемых препаратов ферментов; введение дополнительной процедуры инкубации ферментов в анализируемой пробе и др.?3. Создан банк образцов почв Красноярского края, отличающихся по генезису, гранулометрическому составу, физико-химическим и другим характеристикам анализируемых эталонных проб (рН, ионный состав, катионная емкость, содержание гумуса и его подвижных соединений, ферментативная активность и др.), а также содержанием загрязняющих веществ. На каждый из 100 образцов подготовлен паспорт. Образцы почвы были классифицированы по типу основных загрязнителей (содержание нитратного азота, подвижного фосфора, водорастворимый фтор, валовой мышьяк и свинец). Так же был создан банк 30 эталонных образцов почв, не подвергавшихся антропогенному или техногенному загрязнению. ?4. Разработана лабораторная методика пробоподготовки образцов почв, включающая условия отбора образцов почв, подготовки их экстрактов, условий хранения проб почвы и их экстрактов до и в ходе анализа. ?5. Написан текст методических указаний для проведения экспериментальных работ, позволяющих определить характеристики почв по активности ферментов, входящих в состав комплексного ферментативного тесто ФМО. ?6. В ходе экспериментальной работы:?- Были изучены условия получения экстрактов почвы в зависимости от соотношения «навеска почвы-количество воды или растворителя», природы экстрагирующего раствора, времени и скорости перемешивания и экстракции, условий фильтрования и центрифугирования и др. Предложен вариант пробоподготовки, когда навеску почвы (массой не менее 5,0 г) помещают в коническую колбу и приливают 5-кратный объем дистиллированной воды, перемешивают в течение 30 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Полученные таким образом водные экстракты почвы сохраняли свое влияние на интенсивность биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза+люцифераза после 4 суток хранения при температуре 5 °С.?- Проведена оценка влияния оптических эффектов (светорассеяния, реабсорбции) исследуемых образцов на результаты биолюминесцентного анализа в зависимости от этапов пробоподготовки, геометрии съемки. Поглощение водных экстрактов почв не имеет выраженных полос в диапазоне регистрации 400-600 нм и отличается малым перекрыванием со спектром излучения биолюминесценции. Подсчитанные коэффициенты коррекции показали, что ослабление интенсивности биолюминесценции возможным "эффектом фильтра" не превышает погрешности измерений (<5%). Эти оценки не меняются в зависимости от различий в геометрии съемки на разных регистрирующих приборах - биолюминометрах. Вместе с тем, исследование спектров поглощения и других оптических характеристик экстрактов почв представляется перспективным в качестве альтернативного метода оценки качественного и количественного состава экстрагируемых из почвы веществ.?- Показатель биолюминесценции сильно (в 1,9-2,7 раза) увеличивается по профилю ряда почв. Зависимости между показателем биолюминесценции и содержанием гумуса, подвижных гумусовых веществ тесные, обратные (r = - 0,74±0,17 – 0,84±0,14). Для объективной оценки степени загрязнения почв необходимо нивелировать влияние гумусовых веществ. При низком содержании гумуса, менее 0,77-1,41%, и содержании подвижных гумусовых веществ менее 50 мгС/100г тушения биолюминесценции не происходит и оценочный показатель биолюминесценции можно использовать для определения загрязнения почв.?7. Сравнение результатов биолюминесцентного ферментативного тестирования эталонных проб почвы с результатами физико-химического анализа выявило факторы, от которых зависит степень воздействия образцов почв на результаты ферментативного биотестирования: температура, рН, ионная сила, природа растворителя для экстракции.?8. На примере влияния фуллеренов и наноматериалов, симулирующих гуминовые соединения, на биолюминесценцию предложены подходы для корректировки условий проведения ферментативного тестирования почв для минимизации ингибирующего воздействия на ферментативную активность?9. Биотест ФМО апробирован на разного типа коммерчески существующих биолюминометрах, а также на портативном биолюминометре Люмишот (ООО «НПП «Прикладные системы»). Для выполнения задач проекта был разработан новый макетный образец термостатируемого варианта прибора «Люмишот+» для полевых исследований, позволяющий работать в более широком спектре температур. Проведена проверка пригодности этого прибора для измерения биолюминесценции. ?10. Продемонстрирована принципиальная возможность применимости результатов биолюминесцентного анализа ФМО в качестве интегрального показателя характеристики почв на примере почв Красноярского края (ОПХ «Минино», «Погорельский бор», ОПХ «Солянское» и др.).?11. Подготовлено и опубликовано 13 публикаций, в том числе принято к опубликованию 4 статьи в высокорейтинговые журналы.?12. Результаты проекта были представлены в виде устных и постерных докладов на 6 российских и 6 международных конференциях, таких как 19 Международный симпозиум по био- и хемилюминесценции (29 мая - 2 июня 2016, Цукуба, Япония); VII съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Белгород, 15-22 августа 2016) и другие?13. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту:?1. Городские новости (gornovosti.ru), 22.08.2016 ?http://www.gornovosti.ru/tema/eureka/analiz-za-odnu-minutu85786.htm?2. Монависта (krasnoyarsk.monavista.ru), 07.11.2016?http://krasnoyarsk.monavista.ru/news/2308361?3. ИА 1-LINE (1line.info), 08.11.2016?http://1line.info/nauka-i-tekhnologii-intervyu/item/61328-valentina-kratasuk