Тип публикации: отчёт о НИР
Год издания: 2018
Ключевые слова: биолюминесценция, грибы, биотехнология, тест-системы, люцифераза, светящиеся грибы, Neonothopanus nambi, люциферин, люминесцентная система
Аннотация: В результате работ, выполненных в течение 2018 года, наша научная группа смогла приблизиться к пониманию пространственной структуры белка из принципиально нового семейства, не имеющего описанных гомологов, - люциферазы грибов. В связи с уникальностью открытого нами фермента, и низкой предсказательной силы алгоритмов, рассчитывающихПоказать полностьютрёхмерные пространственные структуры для белков, структура гомологов которых не описана экспериментально, нам удалось получить слабо достоверную модель трёхмерной структуры люциферазы. Однако нами были вполне успешно определены консервативные участки, необходимые для функционирования люциферазы, предсказаны элементы вторичной структуры (6 альфа-спиралей и от 5 до 6 бета-участков для люцифераз различных грибов). С помощью экспериментальных подходов направленного и случайного мутагенеза мы определили роль цистеиновых остатков в белке люциферазы N. nambi: в частности, при точечных заменах на сериновые остатки или остатки, типичные для люцифераз других грибов наблюдалось падение люминесценции в различной степени; при случайном мутагенезе выявлялась тенденция к исчезновению люминесцентной активности при замене аминокислотных остатков Asp127, Arg136, Ser144, Asp173, Arg176, Glu237, Glu238, что дает основание для дальнейших исследований путем сайт-направленного мутагенеза именно этих аминокислот.?Была разработана методика выделения функционально-активной люциферазы nnLuz-CHis, проэкспрессированной в клетках P. pastoris, анализ спектра кругового дихроизма это препарата указывает на то, что люцифераза, выделенная после экспрессии в клетках P.pastoris обладает выраженной вторичной структурой и может быть использована для дальнейшего установления её структуры методами рентгеновской кристаллографии, а также ЯМР.?Кроме того, нами были созданы специфичная количественная тест-система на кофейную кислоту, работающая в пределах концентраций субстрата от 10 mkM до 12,5 mM. При этом предел детекции тест-системы достигает 50 пмоль. ?