Тип публикации: отчёт о НИР
Год издания: 2017
Ключевые слова: биолюминесценция, грибы, биотехнология, тест-системы, люцифераза, светящиеся грибы, Neonothopanus nambi, люциферин, люминесцентная система
Аннотация: Для решения задачи детального изучения новой уникальной грибной биолюминесцентной системы на второй год выполнения проекта было запланировано получение библиотеки кДНК гриба Neonothopanus nambi. Для этого сначала из биомассы биолюминесцентного мицелия этого гриба выделили препарат суммарной РНК, а затем обогатили данный препарат мРПоказать полностьюНК с помощью магнитных частиц, несущих олигонуклеотиды олиго-dT. На следующем этапе на матрице этого обогащённого препарата РНК синтезировали ДНК-РНК гибрид и амплифицировали кДНК гриба Neonothopanus nambi с получением библиотеки двуцепочечной ДНК. Данную библиотеку подготавливали к высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina с помощью лигирования адаптеров TruSeq (Illumina) и проводили специфическую амплицикацию с праймерами от производителя для обогащения молекулами, успешно прошедшими лигирование. Полученный ПЦР-продукт очищали и благодаря вырезанию из агарозного геля для электрофореза соответствующей полосы обогащали последовательностями длиной 300-500 пар оснований. После этого препарат ДНК денатурировали в NaOH 0,1М и растворяли в HT1 буфере (Illumina), доводя до концентрации 10 pM. Затем генерировали кластеры в cBot (Illumina), используя набор реагентов TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS и проводили секвенирование по протоколу парного прочтения (2x100bp) с помощью китов Hiseq200 и TruSeq SBS chemistry. Демультиплексирование проводили с помощью CASAVA-1.8.2 (Illumina). Парные прочтения, полученные на платформе Illumina, анализировали и удаляли из них фрагменты последовательностей адаптеров, а также последовательности нуклеотидов, имеющие низкие значения Phred. Затем из данных удаляли короткие прочтения длиной менее 75 нуклеотидов. Оба этапа проводились программой Trimmomatic c использованием следующих параметров: ILLUMINACLIP:../TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 LEADING:10 TRAILING:10 SLIDINGWINDOW:5:15 MINLEN:70 HEADCROP:10. Полученные процессированные последовательности подвергались дальнейшей фильтрации: проводилась очистка от потенциальных контаминантов c помощью программы Bowtie2 и базы данных Genbank RefSeq. Наконец, из оставшихся прочтений проводили сборку транскриптома Neonothopanus nambi de novo с помощью программы Trinity, используя параметры, заданные в программе по умолчанию.?Для получения аминокислотной последовательности люциферазы проводили гидролиз белка в полиакриламидном геле. Фрагмент полиакриламидного геля, соответствующий белковой полосе или пятну вырезали и подготавливали для проведения масс-спектроскопии с получением пептидной смеси. Для данной пептидной смеси проводили масс-спектрометрическое исследование с помощью метода LC-MS. Среди полученных масс-спектрометрических данных, обработанных оператором, производили поиск кандидатов на роль люциферазы в транскриптоме N. nambi. В результате были идентифицированы несколько возможных генов-кандидатов, которые были впоследствии клонированы в бактерии E. coli. Однако результаты проверки активности дали неоднозначные результаты, не позволяющие с уверенностью идентифицировать люциферазу, что, как выяснилось впоследствии, было связано с неоптимальными условиями экспрессии белков, а также тем фактом, что люцифераза гриба N. nambi является мембранным белком, что затрудняет его правильное сворачивание в клетках прокариот. В связи с полученными данными, было принято решение создать библиотеку кДНК гриба N. nambi и клонировать ее в дрожжи для последующей идентификации клона, экспрессирующего люциферазу.?Для установления нуклеотидной последовательности гена новой люциферазы N. nambi была создана библиотека кДНК. Для этого из свежего мицелия гриба N. nambi была выделена тотальная РНК, обогащена фракцией мРНК и использована в качестве матрицы для синтеза библиотеки кДНК. Данная библиотека была заклонирована в вектор GAP-pPic9K для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris. Линеаризованную библиотеку плазмид кДНК использовали для трансформации штамма Pichia pastoris GS115 электропорацией. Трансформированные клетки рассевали по чашкам Петри с твёрдой питательной средой и выращивали до состояния отдельных различимых колоний. Конечная библиотека кДНК N. nambi содержала около 1 миллиона колоний дрожжей. Каждую чашку Петри с трансформантами опрыскивали раствором люциферина гриба и анализировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer). Из светящихся клонов выделяли геномную ДНК и проводили амплификацию со специфических праймеров на встраиваемую последовательность. Все секвенированные клоны содержали одну и ту же последовательность, соответствующую последовательности гена nnLuz.?Наконец, в наши планы входило клонирование гена новой люциферазы N. nambi, получение бактериального и/или эукариотического штамма-продуцента рекомбинантной люциферазы. Нами были выбраны бактериальный вектор pET23b, дрожжевой вектор pGAP-Kan, и вектор для экспрессии в культурах клеток млекопитающих C1. На основе данных векторов были созданы плазмиды, кодирующие ген nnLuz, которые были названы, соответственно, nnLuz/pGAP_Kan, nnLuz/pET23, nnLuz/C1. Работа данных ДНК-конструкций была проверена в клетках соответствующих организмов: nnLuz/pGAP_Kan в дрожжах P. pastoris GS115, nnLuz/pET23 в бактериях E. coli BL21 CodonPlus (DE3) и nnLuz/C1 в культурах человеческих клеток HEK293T, HeLa и культуре мышиных клеток CT26. В каждом из случаев в ответ на добавление люциферина грибов к клеткам возникала биолюминесценция, которую можно было детектировать люминометром Glomax 20/20 (Promega). С помощью векторов nnLuz/pGAP_Kan, nnLuz/pET23 были созданы штаммы-продуценты рекомбинантной люциферазы: штамм дрожжей P. pastoris GS115 и штамм бактерий E. coli BL21 CodonPlus (DE3), соответственно.