Тип публикации: отчёт о НИР
Год издания: 2015
Ключевые слова: биолюминесценция, Ca2+-регулируемый фотопротеин, люцифераза, целентеразин, кальций, биоимиджинг, диагностика, биосенсор
Аннотация: (1) Методом «висячей капли» проведен скрининг условий кристаллизации для изоформы MLuc7 люциферазы Metridia longa и люциферазы Gaussia princeps. Показано, что люцифераза G. princeps образует маленькие игловидные кристаллы через 15 дней после начала кристаллизации при 16ºС в растворе 1,4 М малоната натрия и в растворе, содержащем 0,Показать полностью1 М янтарной кислоты и 15% ПЭГ3350, а изоформа MLuc7 люциферазы M. longa – в растворе 0,1 М яблочной кислоты и 12% ПЭГ3350. (2) Исследованы биохимические и биолюминесцентные свойства высокоочищенных образцов изоформ люциферазы копепод M. longa и люциферазы G. princeps с целентеразином дикого типа. Установлено, что максимальная биолюминесцентная активность люциферазы из G. princeps (GpLuc) наблюдается при 20ºС, изоформы люциферазы M. longa MLuc7 и MLuc39 имеют температурный оптимум биолюминесцентной реакции в диапазоне 12-15ºС, а изоформа MLuc22 – около 5ºС. Установлено, что максимальная биолюминесцентная активность люциферазы G. princeps и изоформ люциферазы M. longa при 23ºС наблюдается в физиологическом диапазоне рН 7,0-8,0 и при 0,5 М NaCl. Показано, что хотя люциферазы копепод имеют высокую идентичность аминокислотных последовательностей и, вероятнее всего, пространственных структур, максимальная удельная активность изоформ люциферазы M. longa и люциферазы из G. princeps может отличаться почти в 20 раз. (3) Исследованы биолюминесцентные свойства изоформ люциферазы из копепод M. longa с 8-ю новыми аналогами целентеразина. Показано, что с одним из них биолюминесцентная активность изоформы MLuc7 в 10 раз выше, чем с целентеразином дикого типа. (4) Исследован перенос энергии между акворином дикого типа и его мутантом Y89F и желтым флуоресцентным белком TagYFP. Показано, что эффективность переноса энергии для пары мутант акворина Y89F/TagYFP выше, чем для пары акворин дикого типа/TagYFP. Установлено, что в диапазоне использованных концентраций TagYFP при титровании как акворина дикого типа, так и его мутанта Y89F эффективность переноса энергии не достигает насыщения. Сделан вывод, что ни акворин дикого типа, ни его мутант Y89F не образуют комплекс с TagYFP. Это делает пару мутант акворина/TagYFP подходящей для разработки методов мониторинга, например, белок-белковых взаимодействий. (5) Для оценки влияния кинетических параметров на эффективность образования комплекса клитин/cgreGFP из медуз Clytia gregaria, а также на перенос энергии между ними проведены спектрально-кинетические исследования взаимодействия клитина, активированного аналогом целентеразина f, с cgreGFP. Показано, что константа диссоциации комплекса клитин-f/cgreGFP практически не изменяется по сравнению с комплексом клитин-WT/cgreGFP. Сделан вывод, что стадия подъема биолюминесцентной реакции фотопротеина, соответствующая формированию возбужденного состояния продукта, целентерамида, не влияет на перенос энергии между фотопротеином и GFP и, следовательно, на формирование донорно-акцепторного комплекса между этими белками. (6) Химическим синтезом получен ряд конъюгатов обелина с белками (БСА, анти-FAM иммуноглобулин) и специфическими олигонуклеотидами. Изучены их свойства и в модельных экспериментах показана их пригодность для высокочувствительного выявления мишеней, связанных с раком легкого, в растворе и в твердофазном варианте анализа.