Год издания: 2014
Ключевые слова: биолюминесценция, Ca2+-регулируемый фотопротеин, люцифераза, целентеразин, кальций, биоимиджинг, диагностика, биосенсор
Аннотация: Биолюминесценция – известное природное явление. Светящиеся организмы встречаются среди бактерий, грибов, простейших, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и рыб. И хотя они стоят на разных ступенях эволюции, все же одинаковы по природе свечения. Фактически, биолюминесценция – это хемилюминесцентная реакция, в которой происПоказать полностьюходит окисление субстрата – люциферина, катализируемое специфическим ферментом – люциферазой. Люциферины и люциферазы разных организмов – соединения различной структуры и поэтому это, скорее, собирательное и функциональное понятие, чем структурно-химическое. Это также показывает, что биолюминесценция многократно и независимо возникала в ходе эволюции. Неослабевающее внимание к ней отчасти объясняется желанием исследователей как понять молекулярный механизм функционирования конкретных биолюминесцентных белков из различных организмов, так и установить общие закономерности, лежащие в основе конверсии энергии химических связей субстрата в свет видимого диапазона, происходящей при участии белков. И все-таки основной движущей силой, определяющей интерес к изучению биолюминесценции, является возможность создания высокочувствительных аналитических систем на основе биолюминесцентных белков для применения в медицинской диагностике и визуализации внутриклеточных процессов in vivo на уровне клетки и целого организма. Сейчас аналитические направления с использованием биолюминесценции интенсивно развиваются и, вероятнее всего, в настоящее время не найдется области экспериментальной биологии и медицины, где биолюминесцентные белки или уже широко не применялись бы или не были бы опробованы, показав свою пригодность и потенциальные возможности как аналитического инструмента.??Среди нескольких люциферинов, идентифицированных в морских организмах, наиболее широко распространены целентеразин и его производные, например, такие как Vargula люциферин. Целентеразин и его производные идентифицированы как субстрат биолюминесцентной реакции в радиоляриях, ктенофорах, кишечнополостных, копеподах, остракодах, некоторых рыбах, кальмарах, а также, вполне вероятно, являются субстратом и во многих других, еще неисследованных светящихся организмах. Однако, несмотря на использование одного и того же субстрата, биолюминесцентные реакции, а также катализирующие их белки, отличаются поразительным разнообразием. В настоящее время среди этих биолюминесцентных белков изучена лишь малая часть, что не позволяет сделать обобщающих заключений о сходстве и разнообразии их структурно-функциональной организации.??В рамках данного проекта планируется исследовать механизм функционирования рекомбинантных биолюминесцентных и флуоресцентных белков, входящих в состав целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем кишечнополостных и копепод. Для этого предполагается исследовать биолюминесцентные и биохимические свойства белков и их мутантов, провести скрининг условий кристаллизации для изоформ секретируемой люциферазы из копепод Metridia longa, а также ряда мутантов Са2+-регулируемых фотопротеинов, и определить их пространственные структуры с целью установления ключевых аминокислотных остатков, участвующих в катализе и формировании эмиттера. С помощью методов быстрой спектрокинетики ("stopped-flow") также предполагается исследовать механизм безызлучательного переноса энергии между биолюминесцентными белками и их мутантами и флуоресцентными белками (BRET) из различных организмов. Актуальность предлагаемых фундаментальных исследований определяется их прикладной значимостью, так как на их основе предполагается сконструировать новые биолюминесцентные репортерные белки и разработать новые методы анализа для применения в медицинской диагностике, клеточной биологии, и биотехнологии, что также является одной из задач предлагаемого проекта.