Тип публикации: диссертация
Год издания: 2018
Аннотация: В настоящее время стремительно развиваются технологии неинвазивной визуализации молекулярных процессов in vivo. Технологии биоимиджинга стали прорывом в области прижизненных исследований динамических процессов в клетках, тканях и целых организмах. Проведение современных прикладных и фундаментальных исследований в области медицины, Показать полностьюфармакологии и биотехнологии требует дальнейшего развития методов для прижизненной визуализации. Наряду с технологиями, основанными на применении флуоресцентных белков и красителей, в биоимиджинге все активнее используют репортерные системы на основе биолюминесцентных белков. Популярность таких систем в первую очередь определяется высокой чувствительностью обнаружения биолюминесцентного репортера и отсутствием токсичности для клеток и организмов [Badr, 2014]. Для совершенствования существующих технологий биолюминесцентного имиджинга, а также разработки новых методик необходим широкий спектр светоизлучающих белков с различными биохимическими свойствами. На сегодняшний день все имеющиеся биолюминесцентные белки имеют те или иные недостатки и ограничения для применения в качестве репортерных – потребность в различных кофакторах, низкий квантовый выход биолюминесцентной реакции и т.д. Поэтому дальнейшее развитие технологий биолюминесцентного биоимиджинга идет по пути поиска новых биолюминесцентных природных белков и улучшения свойств уже используемых репортеров методами белковой инженерии. Сегодня среди известных биолюминесцентных белков в качестве репортерных наиболее часто используют люциферазы светляков, бактерий, кораллов и ракообразных, а также фотопротеины. Все эти белки различаются аминокислотными последовательностями, структурами, субстратами и кофакторами, квантовым выходом реакции и т.д. Поэтому при выборе репортера для биолюминесцентного биоимиджинга, прежде всего, учитывают особенности объекта исследования, в котором предполагается использовать репортерную систему, а также свойства самого репортера (спектр излучения, молекулярная масса, потребность в кофакторах, стабильность и т.д.). Биолюминесценция морских планктонных рачков копепод обусловлена секретируемой люциферазой, использующей, аналогично многим другим биолюминесцентным белкам, целентеразин в качестве субстрата [Markova, Vysotski, 2015]. На сегодняшний день идентифицированы гены люцифераз из копепод Gaussia princeps, Metridia pacifica, Metridia longa и др. Все эти люциферазы имеют небольшую молекулярную массу (до 22 кДа), проявляют высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей и требуют для биолюминесцентной реакции присутствия только субстрата и кислорода, т.е. относятся к семейству кофактор-независимых монооксигеназ [Markova, Vysotski, 2015; Takenaka et al., 2017]. С момента клонирования в начале 2000-х годов генов, кодирующих секретируемые люциферазы копепод из G. princeps и M. longa, эти белки сразу же были опробованы в качестве репортерных в различных экспериментах in vivo и in vitro, показав свою перспективность [Verhaegen, Christopoulos, 2002; Markova et al., 2004]. Секретируемые биолюминесцентные репортерные белки чрезвычайно удобны для биоимиджинга, так как их можно выявлять без разрушения исследуемых клеток или тканей. Биолюминесцентный сигнал при использовании таких репортеров возможно регистрировать в культуральной среде, межклеточных жидкостях, крови, лимфе и других жидких средах [Tannous et al., 2009; Homaei et al., 2017]. Хотя сегодня секретируемые люциферазы копепод (в основном из G. princeps и M. longa) активно используются в биоимиджинге, биолюминесцентные и биохимические свойства этих белков изучены неполно. В первую очередь это обусловлено трудностями получения достаточных количеств высокоочищенных активных люцифераз с помощью бактериальных систем экспрессии: в нативной конформации белки содержат несколько внутримолекулярных дисульфидных связей, необходимых для функционирования фермента.